Proč váš experimentální WB neustále selhává? Podívejte se na následující důvody!

Dnes si promluvme o problému, který způsobil experiment s hlavami hlavy bezpočet kolegů - Western Blot (WB). Tento zdánlivě jednoduchý, ale plný experimentu „pastí“, proč nás to vždycky znovu a znovu narazí? Nyní se podívejme na důvody selhání společně.

I. Žádné kapely

Možné důvody mohou zahrnovat:

1. Protilátkové problémy: Protilátka může být neúčinná, nespecifická nebo nevázaná na cílový protein.
2. Problémy s vzorkem: Vzorek může obsahovat interferující látky, být příliš nízký v koncentraci nebo již degradován.
3. Problémy s elektroforézou: Nepříznivé podmínky elektroforézy, jako je napětí, čas nebo nesprávné použití pufru.
4. Problémy s přenosem: Problémy během procesu přenosu, jako je nevhodný výběr membrány, doba přenosu nebo vyrovnávací paměť přenosu.
5. Problémy s blokováním: Blokovací řešení může být nevhodné nebo doba blokování může být příliš dlouhá.
6. Problémy s barvením: Barvení činidlo může být vypršeno, necitlivé nebo nesprávně použity.

Problémy s vybavením: Zařízení může nefunkční nebo ne správně kalibrováno.

1. Experimentální provozní problémy: Experimentální operace nemusí být standardizována, jako je nedostatečné praní nebo nerovnoměrné zatížení vzorku.
2. Problémy s modifikací proteinu: Cílový protein může podstoupit posttranslační modifikace, které brání rozpoznávání protilátek.
3. Problémy s expresí cílového proteinu: Cílový protein může mít velmi nízkou expresi nebo žádnou expresi v detekovaných buňkách nebo tkáních.

Ii. Vysoké pozadí

Možné důvody mohou zahrnovat:

1. Vysoká koncentrace protilátek: Použití příliš velkého množství protilátky může zvýšit nespecifickou vazbu, což má za následek vysoké pozadí.
2. Protilátkové problémy: Protilátka může mít vysokou nespecifickou vazbu nebo zkřížený reagovat s jinými proteiny.
3. Nedostatečné blokování: Blokovací roztok nedokáže účinně pokrýt nespecifická vazebná místa na membráně, což vede k vysokému pozadí.
4. Problémy s membránou: Membrána může mít špatnou kvalitu nebo kontaminaci, což vede k vysokému pozadí.
5. Neúplný přenos: Během procesu přenosu nemusí být proteiny plně přeneseny na membránu, což má za následek vysoké pozadí.
6. Nedostatečné promytí: Schody promývání nedokážou účinně odstranit nevázanou protilátku nebo jiné nečistoty, což vede k vysokému pozadí.
7. Problémy s barvením činidla: barvicí činidlo může být příliš citlivé nebo nestabilní, což má za následek vysoké pozadí.
8. Problémy s experimentálním zařízením: Zařízení může mít únik nebo rušení, což vede k vysokému pozadí.
9. Problémy s proteinem: Vzorek může obsahovat velké množství interferujících látek, jako jsou produkty degradace proteinů nebo jiné nečistoty.
10. Experimentální provozní problémy: Experimentální operace nemusí být standardizována, jako je prodloužená doba inkubace nebo vysoká teplota.

Iii. Nespecifické pásy nebo nesprávné velikosti proteinových pásů

Možné důvody mohou zahrnovat:

1. Příliš mnoho průchodů buněk, což má za následek různé úrovně exprese proteinu, což vede k nekonzistentní velikosti pásma nebo přítomnosti více pásů.
2. Degradace vzorku proteinu, což vede k nižší molekulové hmotnosti bílkovin nebo přítomnosti více pásů.
3. In vivo exprimované vzorky proteinů mohou mít různé formy modifikací, jako je acetylace, methylace, alkylace, fosforylace a glykosylace, což vede k nekonzistentní velikosti pásma nebo přítomnosti více pásů.
4. Cílový protein obsahuje více izoforem nebo sestřihových variant, což má za následek nekonzistentní velikosti pásma nebo přítomnosti více pásů.